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   雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定 DNA 的含量 

  雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)法測(cè)定核酸的含量，操作簡(jiǎn)便、 快速、 靈敏、 用量少、 對(duì)樣品無(wú)損害，是一種常用的核酸測(cè)定方法。 

一、實(shí)驗(yàn)原理 

DNA 和 RNA 都有吸收紫外光的性質(zhì)，它們的zui大吸收峰在波長(zhǎng) 260 nm 處。這是嘌呤 環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵系統(tǒng)所具有的，凡是含有嘌呤和嘧啶的一切物質(zhì)，不論是核苷、核苷酸，均具有吸收紫外光的特性。核苷和核苷酸的摩爾消光系數(shù)ε (P)(或吸收系數(shù))表示為: 每升溶液中含有 1 mol 原子磷的消光值(即光密度或稱(chēng)光吸收值)。RNA 的ε (P)260 nm (pH 7.0)為7700～7800。RNA 的含磷量約 9.5 % ，因此，每毫升溶液含 1μg RNA 的光吸收值相當(dāng)于0.024。計(jì)算如下: 

原子磷量: 1 mol / L = 31 g / 1000 mL = 31 mg / mL(磷相對(duì)原子質(zhì)量：31) RNA 量: 31 mg / mL÷9.5 % = 330 mg / mL 1 mg / mL RNA 的光吸收值: 7800÷330 = 24 1μg / mL RNA 的光吸收值: 0.024 再如，小牛胸腺 DNA 鈉鹽的ε (P)2 60 nm (pH 7.0)為 6600，含磷量為9.2 % ， 因此，每毫升溶液含 1μg DNA 鈉鹽的光吸收值為 0.020。由于蛋白質(zhì)分子中含有芳香族氨基酸，因此，也具有吸收紫外光的特性。通常蛋白質(zhì)的zui大吸收峰在波長(zhǎng) 280 nm 處，而在 260 nm 處的吸收值僅是核酸的 1 / 10 或更低，故核酸樣品中蛋白質(zhì)含量較低時(shí)，用紫外法測(cè)定核酸含量的影響不大。RNA 的260 nm 與 280 nm 的光吸收比值在 2.0 以上，DNA 的 260 nm 與 280 nm 光吸收的比值在 1.9 左右。當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)含量較高時(shí)，比值下降。 

二、器材與試劑 (一)、器材 

25 mL、 50 mL容量瓶，離心機(jī)，  UV1901PC雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

 (二)、試劑 

DNA 溶液的配制： 取20 mg 豬脾 DNA 鈉鹽制品，先用少量0 .1 mol / L NaOH 使其溶解，用0.05 mol / L NaOH 溶液定容至 25 mL，濃度為0.8 mg / mL。 

三、實(shí)驗(yàn)步驟 

(一)、DNA 光吸收曲線(xiàn)的繪制 

準(zhǔn)確吸取0.5mL DNA 溶液(0.8 mg/mL)置于 25 mL容量瓶?jī)?nèi)，用蒸餾水定容至25 mL(稀釋50倍)。取 3 mL 在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定 220～300 nm的光吸收曲線(xiàn)(見(jiàn)圖1)。由光吸收值 A2 60 nm可直接計(jì)算出 DNA 的含量。 

豬脾 DNA 的紫外光吸收曲線(xiàn)與小牛胸腺 DNA 紫外光譜基本一致。 

(二)、DNA 的含量測(cè)定 

將樣品配成 5～50μg / mL 的核酸溶液，在UV1901PC雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上測(cè)定波長(zhǎng)260 nm和 280 nm的光吸收值，根據(jù)以下公式計(jì)算核酸的濃度和光吸收的比值。 

RNA 濃度(μg / mL) =A260 nm×稀釋倍數(shù)/0.024×比色杯厚度(cm) DNA 濃度(μg / mL) =A2 60 nm×稀釋倍數(shù)/0.020×比色杯厚度(cm) 式中的 A2 60 nm為波長(zhǎng) 260 nm 處的光吸收讀數(shù)。 

如果待測(cè)樣品中含有酸溶性核苷酸或可透析的寡核苷酸，在測(cè)定時(shí)需要用鉬酸銨-過(guò)氯酸沉淀劑沉淀，除去大分子核酸。具體操作如下： 

取兩支小離心管，甲管加0.5mL 樣品和0.5mL 蒸餾水，乙管加入0.5mL 樣品和0.5mL鉬酸銨-過(guò)氯酸沉淀劑，搖勻后，放置冰浴中30 min，以3000 r / min 離心10 min，從甲、乙兩管中分別吸取0.4mL 上清液到兩個(gè)50 mL 容量瓶?jī)?nèi)，定容至刻度，于UV1901PC雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上測(cè)定波長(zhǎng)260 nm 的光吸收值。 

RNA(或 DNA)濃度(μg / mL) =測(cè)得的吸光值差(ΔA26 0 n m )× 稀釋倍數(shù)/0.024(或 0.020)× 比色杯厚度(cm) 

式中ΔA260 nm為甲管稀釋液在波長(zhǎng) 260 nm 處的吸收值減去乙管稀釋液在波長(zhǎng) 260 nm 處的吸收值。 

核酸含量( % ) =待測(cè)液中測(cè)得的核酸μg數(shù)/待測(cè)液中待測(cè)品的μg 數(shù) ×100