第二法福林酚法(1^ * 17法>
本法系依據(jù)蛋白質(zhì)分子中含有的肽鍵在堿性溶液中與
C u 2+螯合形成蛋白質(zhì)-銅復(fù)合物,此復(fù)合物使酚試劑的磷鉬
酸還原,產(chǎn)生藍(lán)色化合物,同時(shí)在堿性條件下酚試劑易被蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸還原呈藍(lán)色反應(yīng)。在
一定范圍內(nèi)其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比,以蛋白質(zhì)對(duì)
照品溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線,采用比色法測(cè)定供試品中蛋白質(zhì)的
含童。
本法靈敏度高,測(cè)定范圍為20.25C^ g。但對(duì)本法產(chǎn)生
干擾的物質(zhì)較多,對(duì)雙縮脲反應(yīng)產(chǎn)生干擾的離子,同樣容易
干擾福林酚反應(yīng),且影響更大。如還原物質(zhì)、酚類(lèi)、枸櫞
酸、硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、甘氨酸、糖類(lèi)、甘
油等均有干擾作用。
除另有規(guī)定外,按方法1操作;如有干擾物質(zhì)時(shí),除另
有規(guī)定外,按方法2操作并需經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證。
方法1:
試劑堿性銅試液取氫氧化鈉I0 g,碳酸鈉50g,加
水400ml使溶解,作為甲液;取酒石酸鉀0.5g,加水50ml
使溶解,另取硫酸銅0.25g,加水30ml使溶解,將兩液混
合作為乙液。臨用前,合并甲、乙液,并加水至500ml。
對(duì)照品溶液的制備除另有規(guī)定外,取血清白蛋白(牛)
對(duì)照品或蛋白質(zhì)含量測(cè)定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品,加水溶解并制成每
lm l中含0. 2mg的溶液。
供試品溶液的制備照各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法制備(蛋
白質(zhì)濃度應(yīng)與對(duì)照品溶液基本一致)。
測(cè)定法精密量取對(duì)照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、
0. 6mK 0.8ml、1. Oml(對(duì)照品溶液取用量可在本法測(cè)定范
圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整),分別置具塞試管中,各加水至l.Otnl,
再分別加入堿性銅試液1 .0 m l,搖勻,室溫放置1 0分鐘,
各加人福林酚試液[ 取福林試液中的貯備液(2m o l/L酸濃
度)1—16] 4 .0 m l,立即混勻,室溫放置3 0分鐘,照紫外-
可見(jiàn)分光光度法(通則0401),在650mn的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光
度;同時(shí)以0 號(hào)管作為空白。以對(duì)照品溶液濃度與其相對(duì)應(yīng)
的吸光度計(jì)算線性回歸方程。另精密量取供試品溶液適量,
同法測(cè)定。從線性回歸方程計(jì)算供試品溶液中的蛋白質(zhì)濃
度,并乘以稀釋倍數(shù),即得。
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